熒光定量PCR儀的熱蓋失效或故障最主要的表現(xiàn)是：控溫不準和液體揮發(fā)，反應液揮發(fā)會最終導致曲線不擴增，呈斜線上升。首先可通過曲線判斷熱蓋是否故障，若確定熱蓋已經(jīng)壞了，建議可以在每個PCR反應管中加入一層礦物油（礦物油可避免反應液揮發(fā)），上機測試曲線結(jié)果是否正常。如曲線仍然異常，則建議請儀器工程師現(xiàn)場維修，甚至直接更換熱蓋。

　　通常我們建議在實驗室配備UPS電源，這樣能夠保證PCR儀器運行過程中的正常供電，從而保證程序的正常運行。PCR儀器在運行中突然斷電的話，如儀器有斷電保護功能，則可直接繼續(xù)運行程序。如實驗室無UPS電源，突然斷電而導致PCR程序不能完成，為了保證實驗結(jié)果的真實性，建議只能重復實驗再上機檢測。

要判斷自己的PCR儀器是否正常，可從以下幾方面考慮：1.    儀器開關(guān)機，與軟件連接是否正常。2.    儀器運行同樣的實驗所需要的時間是否跟平時一致，由此判斷儀器的加熱制冷模塊是否正常。3.    曲線結(jié)果是否呈明顯的S型，若曲線異常，如呈曲折上升狀，則可能是熱蓋問題，或者是熒光檢測裝置出現(xiàn)問題。4.    若曲線的熒光值與平時相比，明顯降低，則要考慮是否需要更換儀器光源（尤其是鹵素燈，其光源壽命約2000h）。5.    若儀器某一孔或幾孔的熒光值明顯高于其他孔位，則需要考慮儀器的孔槽或檢測光路是否受到熒光污染，建議清洗儀器孔槽后再進行測試。

　　如實驗室的擴增產(chǎn)物泄露，造成實驗室的污染，那么后果將非常嚴重。要去除污染，首先最重要的是保持通風，保證擴增產(chǎn)物片段能順利擴散出去；其次可采用稀酸處理法，對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；再次采用紫外照射法，紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大；最后若污染長時間不能消除，建議更換另外廠家的PCR試劑進行檢測，因為每個廠家的引物設(shè)計區(qū)域不一樣；一般情況下，一家試劑公司的擴增產(chǎn)物不會在另外一家廠家的引物設(shè)計區(qū)域內(nèi)，因此不會造成產(chǎn)物污染的假陽性。

1）為了保證檢測質(zhì)量，臨床PCR實驗室應有充分合理的空間，良好的照明和空調(diào)設(shè)備。工作環(huán)境雖不是檢測質(zhì)量的直接原因，但寬敞舒適的實驗室環(huán)境將肯定有利于檢驗質(zhì)量的保證。

2）合理有效地對儀器設(shè)備進行管理，定期做維護和校準，使其處于一個良好的狀態(tài)。例如，定期校準移液器，使其保持足夠的準確度和精密度。定期維護熒光定量PCR儀的光學系統(tǒng)和反應孔間溫度差異，使其保持在良好狀態(tài)和允許的范圍內(nèi)。此外，還包括天平，離心機，冰箱等設(shè)備的管理。

3）理想的試劑：主要有內(nèi)外兩個因素，內(nèi)在因素包括標本處理方法，用于核酸擴增的原材料及方法學設(shè)計等。外出因素包括試劑盒的運輸和保存中的問題。

4）標準化操作流程：完整的臨床PCR程序由標本采集，運送，保存，編號，試劑準備，核酸提取，擴增和產(chǎn)物檢測，結(jié)果分析和報告等諸多環(huán)節(jié)，建立科學和與本實驗室配套的SOP文件，嚴格按SOP進行操作。

5）主要污染源和防污染措施：PCR的主要污染源有標本中的大量待測微生物，克隆質(zhì)粒，大量存在實驗室中的特定微生物以及以前擴增產(chǎn)物的殘留污染等。這些都是實驗室最容易造成假陽性的污染。因此，必須嚴格分區(qū)實驗室及遵守工作流程，使用化學清潔實驗臺面，使用紫外線照射和UNG方法消除擴增產(chǎn)物污染等等。

6）進行室內(nèi)和室間質(zhì)量控制，室內(nèi)質(zhì)量控制可以確保實驗室室內(nèi)測定質(zhì)量的一致性，室間質(zhì)量控制可以提供將實驗室測定情況與一室間和客觀標準進行回顧性比較的數(shù)據(jù)。

　　國內(nèi)外文獻報道證實，乙肝兩對半標志物全陰性的病人不能排除HBV DNA感染，主要是因為HBV DNA的檢測窗口期出現(xiàn)早于乙肝血清標志物，因此此類患者可能處于乙肝感染早期。 　　乙肝感染后，在乙肝“兩對半”檢測中，表面抗原HBsAg出現(xiàn)最早，一般在感染3周后出現(xiàn)，而HBV DNA的檢測能將窗口期縮短至6-15天，乙肝兩對半全陰的標本HBV DNA為陽性，是因為病人處于感染乙肝病毒的初期，免疫學的檢測窗口期比基因檢測的窗口期長，導致兩對半檢測結(jié)果為陰性，由此可知：HBV DNA的檢測，對于疾病的早期診斷有著非常重要的意義。

　　HBV-DNA檢查是反應乙肝病毒復制程度和傳染性大小的最直接指標。臨床數(shù)據(jù)顯示，在乙肝兩對半大三陽病例  中，HBV DNA陽性的檢出率極高，但HBV DNA陰性的結(jié)果也是很有可能的。一般乙肝大三陽HBV-DNA陰性雖然表明患者病毒未超標，但大三陽結(jié)果提示患者感染乙肝病毒，且具有較強傳染性。盡管如此，臨床檢驗者也可能遇到大三陽標本HBV DNA檢測不出的情況。首先對于這樣的標本，可以將標本進行稀釋后進行復查，排除血清或血漿標本中存在抑制物或者陽性標本HBV DNA濃度超過試劑盒上限而導致PCR擴增失敗的情況。其次，乙肝病毒發(fā)生變異也是導致PCR擴增不出的原因之一，通常都是用藥治療患者的乙肝病毒核酸序列發(fā)生了突變。如經(jīng)過多種PCR試劑檢測失敗后，可進行DNA測序以確定乙肝病毒及其變異位點，以指導臨床醫(yī)生用藥治療。最后， 可更換另一廠家試劑進行檢測，排除原試劑本身設(shè)計缺陷而造成漏檢的情況。

實時熒光定量PCR擴增曲線包括基線期，指數(shù)擴增期，線性擴增期和擴增平臺期，標準的曲線應該呈典型的S型。不規(guī)則曲線可以根據(jù)曲線的具體情況來分析：1）曲線呈斜線上升原因：熱蓋失靈或熱蓋沒蓋緊，導致控溫不準、液體揮發(fā)。解決辦法:更換儀器熱蓋或?qū)嵘w蓋緊。圖1 曲線呈斜線上升2）擴增曲線分成兩段（斷裂）圖2擴增曲線分成兩段（斷裂）原因：基線的終點大于Ct值，通常是因為模板DNA濃度偏高，CT值< 15，而基線仍然取3-15，其中包含部分擴增信號，導致曲線被壓下去。解決方法：減小基線終點，至Ct值前4個循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)。3）直線擴增曲線圖3 某些樣本出現(xiàn)直線擴增曲線原因：探針部分降解解決辦法:建議更換試劑進行測試。4）曲線平臺期下掉原因：蓋子沒蓋緊解決辦法:PCR反應管蓋子蓋上后，檢查蓋子是否蓋緊。圖4 曲線平臺期下掉